Познати се геномските секвенци на повеќето вируси.Сонди на нуклеинска киселина кои се кратки сегменти на ДНК дизајнирани да се хибридираат со комплементарни вирусни ДНК или РНК сегменти.Полимеразната верижна реакција (PCR) е поефикасна техника за откривање на вируси.Неодамна се развиени дијагностички методи со висока пропусност.
А. Техника на хибридизација на нуклеинска киселина
Хибридизацијата на нуклеинска киселина, главно вклучувајќи Southern blotting (Southern) и Northern blotting (Northern), е нова техника која брзо се развива во полето за дијагностицирање на вирусот.Образложението на анализата за хибридизација е да се користат кратки сегменти на ДНК (наречени „сонда“) дизајнирани да се хибридираат со комплементарни вирусни ДНК или РНК сегменти.Со загревање или алкална обработка, двоверижната целна ДНК или РНК се одделуваат во единечни жици и потоа се имобилизираат на цврста потпора.После тоа, сондата се додава и хибридизира со целната ДНК или РНК.Бидејќи сондата е означена со изотоп или нерадиоактивен нуклид, целната ДНК или РНК може да се детектираат преку авторадиографија или преку системот биотин-авидин.Бидејќи повеќето од вирусните геноми се клонирани и секвенционирани, тие може да се детектираат со користење на специфични секвенци за вирусот како сонди во примерокот.Моментално, методите на хибридизација вклучуваат: точкаст блот, in situ хибридизација во клетките, ДНК blotting (ДНК) (Southern blot) и RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B.PCR технологија
Во последниве години, развиена е серија на ин витро техники за засилување на нуклеинската киселина врз основа на PCR, за тестирање на нечувствителни или некултивирани вируси.PCR е метод кој може да синтетизира специфична ДНК секвенца со ин витро полимеразна реакција.Процесот на PCR вклучува термички циклус од три чекори: денатурација, жарење и екстензија На висока температура (93℃~95℃), двоверижната ДНК се дели на две единечни ДНК нишки;потоа на ниска температура (37℃~60℃), два синтетизирани нуклеотидни прајмери се анектираат до комплементарните ДНК сегменти;додека при соодветна температура за ензимот Taq (72℃), синтезата на нови ДНК синџири започнува од прајмерот 3'крај користејќи комплементарна ДНК како шаблони и единечни нуклеотиди како материјали.Така, по секој циклус, еден синџир на ДНК може да се засили на два синџири.Повторувајќи го овој процес, секој синтет на ДНК синтетизиран во еден циклус може да се користи како шаблон во следниот циклус, а бројот на синџири на ДНК се удвојува во секој циклус, што значи дека производството на PCR се засилува со брзина од 2n лог.По 25 до 30 циклуси, производството на PCR се идентификува преку електрофореза, а специфичните ДНК производи може да се набљудуваат под УВ светлина (254 nm).Заради неговата предност во специфичноста, чувствителноста и практичноста, PCR е усвоен во клиничката дијагноза на многу вирусни инфекции како што се ХЦВ, ХИВ, ЦМВ и ХПВ.Бидејќи PCR е многу чувствителен, може да открие вирусна ДНК на ниво на fg, операцијата треба да се изврши многу внимателно за да се избегне лажно позитивно.Дополнително, позитивниот резултат на тестот за нуклеинска киселина не значи дека има жив инфективен вирус во примерокот.
Со широка примена на PCR техниката, се развиваат нови техники и методи базирани на PCR техника за различни цели на тестирање.На пример, квантитативната PCR во реално време може да открие вирусно оптоварување;in situ PCR се користи за да се идентификува вирусна инфекција во ткивото или клетките;Вгнездената PCR може да ја зголеми специфичноста на PCR.Меѓу нив, квантитативната PCR во реално време е развиена побрзо.Многу нови техники, како што се сондата за хидролиза TaqMan, сондата за хибридизација и сондата со молекуларен светилник, се комбинирани во квантитативна PCR техника во реално време, која е широко користена во клиничките истражувања.Покрај прецизното идентификување на вирусното оптоварување во телесните течности на пациентите, овој метод може да се користи и за откривање на мутант толерантен на лекови.Затоа, квантитативната ПЦР во реално време главно се применува при евалуација на куративниот ефект и надзор на толеранција на лекови.
В. Откривање на вирусни нуклеински киселини со висок процент
За да се задоволат потребите за брза дијагностика на новите појавни заразни болести, воспоставени се различни методи за откривање со висока моќност, како ДНК чипови (ДНК).За ДНК-чиповите, специфичните сонди се синтетизираат и се прикачуваат на мали силиконски чипови со многу висока густина за да формираат микрониза со ДНК сонда (ДНК) која може да се хибридизира со примерок.Сигналот за хибридизација може да се сними со конфокален микроскоп или ласерски скенер и понатаму да се обработува од компјутерот и може да се добие огромен сет на податоци за различни гени.Постојат два вида ДНК чипови.„Синтезниот чип“ е како што следува: специфичните олигонуклеотиди се синтетизираат директно на чиповите.Друг е ДНК чип за базен.Клонираните гени или производите на PCR се уредно испечатени на слајдот.Предноста на технологијата на ДНК чипови е истовремено откривање на огромно количество ДНК секвенци.Најновата верзија на чипот за откривање патогени може да идентификува над 1700 човечки вируси одеднаш.Технологијата на ДНК чипови ги реши проблемите на традиционалните методи на хибридизација на нуклеинските киселини и има многу широка примена во вирусна дијагноза и епидемиолошки студии.
Време на објавување: Декември-23-2020 година